KASP（Kompetitive Allele-Specific PCR，競爭性等位基因特異性PCR）是一種基于PCR的基因分型技術(shù)，主要用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）和其他特定基因變異。廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)育種、醫(yī)學(xué)研究、群體遺傳學(xué)等領(lǐng)域。

引物設(shè)計(jì)開發(fā)流程如下

1. 獲取SNP信息，要求兩親本在SNP位置的堿基序列不同，同時(shí)該SNP上游20bp、下游40bp無其他SNP, SNP信息可通過全基因組測(cè)序得到，也可通過重測(cè)序得到；
2. 提取親本DNA、F1代DNA并稀釋到5-50ng/ul備用(也可以不稀釋，后面擴(kuò)增體系里面用水補(bǔ)齊)；
3. 引物設(shè)計(jì)：

• 從SNP所在堿基開始往上游數(shù)20bp作為左引物f，SNP的堿基作為左引物的第20個(gè)堿基，于是有左引物f1，f2;
• 使用引物設(shè)計(jì)軟件或引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）固定左引物f，通過blast得到右引物R，產(chǎn)物大小需小于60bp；
• 左引物f1、f2分別加上接頭A1、A2（接頭序列A1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，A2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT）序列為F1、F2，即F1=A1f1，F(xiàn)2=A2f2；
• 合成序列F1，F(xiàn)2，R，選用ULTRPAGE純化方式；

4. 將引物干粉溶解，F(xiàn)1、F2濃度為36uM，R濃度為90 uM，然后三種引物按體積比1:1:1混勻?yàn)閜rimer mix；
5. 引物篩選：每種引物每個(gè)親本及F1最少跑2個(gè)孔。

PCR擴(kuò)增體系如下

6. 擴(kuò)增結(jié)束后使用熒光定量PCR讀帶：讀帶程序如下：
   25℃ for 5s + Plate Read。讀帶完成后，選定熒光類型FAM、HEX、ROX,選擇Allelic Discrimination進(jìn)行分析
7. 挑選其中聚類明顯的引物（如右圖）作為候選標(biāo)記。
8. 將候選標(biāo)記用于群體，若聚類效果明顯則可作為KASP標(biāo)記，聚類效果不明顯則不能作為標(biāo)記。