PCR教學試劑盒
Cat. #：P8021，P8022
產(chǎn)品簡介
本試劑盒是按照教學實驗內(nèi)容設計的，符合標準擴增流程的，教學用PCR反應試劑盒。本試劑盒所提供的模板為插入特定大小DNA片段的PBluescipt SK（+）重組質(zhì)粒；引物為根據(jù)所插入DNA序列和擴增片段大小不同設計的上下游引物。PCR結(jié)果可獲得特定大?。?00 bp或1,000 bp）的PCR產(chǎn)物。
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產(chǎn)品組成
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Component |
P8021 （500 bp，30次） |
P8022 （1,000 bp，30次） |
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DNA模板 |
150 μl，500 bp |
150 μl，1,000 bp |
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上游引物?(10 μM) |
75 μl |
75 μl |
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下游引物(10 μM) |
75 μl |
75 μl |
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dNTP混合物(2.5 mM) |
150 μl |
150 μl |
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Taq DNA聚合酶(2.5 U/μl) |
40 μl |
40 μl |
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10×PCR緩沖液 |
500 μl |
500 μl |
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超純水 |
1 ml |
1 ml |
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說明書 |
1份 |
1份 |
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活性定義
一個活性單位（U）指用活性化的大馬哈魚精子DNA作為模板/引物，在72℃、30 min內(nèi)，攝入10 nmol全核苷酸所需的酶量。
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保存條件
10×PCR緩沖液保存于4℃，其他成分-20℃保存。
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質(zhì)量控制
純度檢測：經(jīng)質(zhì)量檢測，產(chǎn)品不含脫氧核糖核酸內(nèi)切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。
功能檢測：PCR方法檢測本試劑盒無宿主殘余DNA，也無其他DNA污染，能有效完成PCR擴增。
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應用舉例
1.?配制反應體系
請于冰上配置反應體系，體系大小與組分用量與添加順序可調(diào)整：
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Ordinal |
Component |
Volume (25 μl reaction volume) |
Volume (50 μl reaction volume) |
Volume (50 μl reaction volume，n管) |
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1 |
10×PCR緩沖液（Mg2+?Plus） |
2.5 μl |
5 μl |
5×(n+1) μl |
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2 |
dNTPs（2.5mM） |
2 μl |
4 μl |
4×(n+1) μl |
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3 |
上游引物?? (10 μM) |
1 μl |
2 μl |
2×(n+1) μl或a μl×(n+1) |
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4 |
下游引物?? (10 μM) |
1 μl |
2 μl |
2×(n+1) μl或a μl×(n+1) |
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5 |
Taq ? DNA聚合酶（2.5U/μl） |
0.5 μl |
1 μl |
1×(n+1) μl或a μl×(n+1) |
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6 |
template ? DNA |
2 μl |
4 μl |
4×(n+1) μl或a μl×(n+1) |
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7 |
超純水 |
16 μl |
32 μl |
32×(n+1) μl |
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8 |
石蠟油 |
如不能設置頂蓋溫度，需適量加入石蠟油。 |
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●?加入各組分后，請用槍頭反復吸吹幾次，充分混勻。
●?在一次配制多管需分裝時建議按（n+1）的反應液量配制，以確保分配時的耗損不會影響實驗，同時選擇大于總體積的離心管便于混勻。
●?如需使用其他體積的PCR反應體系，請按各組分比例縮減或增加各組分用量。
●?組分中引物、DNA模板、Taq DNA聚合酶常用于梯度實驗，如有調(diào)整，請注意調(diào)超純水的用量至相應的體系。
●?將混勻的各管短暫離心，置于PCR儀中。
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2.?設定反應程序進行PCR反應
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Stage ? |
Temperature |
Time |
Number ? of Cycles |
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Initial ? Denaturation |
94℃ |
3 ? min |
1 |
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Denaturation |
94℃ |
30 ? sec |
30 |
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Annealing |
55℃ |
30 ? sec |
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Extension |
72℃ |
30 ? sec or 45 sec |
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Final ? Extension |
72℃ |
5 ? min |
1 |
●?設定PCR程序時，請根據(jù)目的片段大小決定延伸時間，如果目的片段大小為500 bp時，延伸時間為30 sec，目的片段為1 kb時，延伸時間為45 sec。
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3.?分析結(jié)果
反應結(jié)束后取2-5?μl反應產(chǎn)物與loading buffer混勻后進行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像設備觀察目的條帶的擴增情況。
●?500 bp產(chǎn)物建議電泳條件為1.7%瓊脂糖凝膠，0.5×TBE，7 V/cm，20-40 min，建議Marker為?DSTM 2000（M1101）。
●?1 kb產(chǎn)物建議電泳條件為1.0%瓊脂糖凝膠，1×TAE，7 V/cm，20-40 min，建議Marker為?DSTM 5000（M1111）。
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注意事項
請嚴格按照說明書提供的實驗體系及實驗條件進行試驗。
室溫下Taq DNA聚合酶有一定的活性，為避免發(fā)生非特異性擴增，請于冰上配置反應體系，并且最后添加Taq DNA聚合酶或模板DNA。
挑取菌落時，應選擇單菌落，不要挑取太多菌體，以免影響PCR結(jié)果。